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Bestimmung der Folatformen

Die richtige Messung der Folatformen ist für das Monitoring der Folatzufuhr und der Evaluation des Folatstatus essentiell. Die Quantifizierung der Folatformen im Vollblut spiegelt den langfristigen Folatstatus im Körper wieder. Der Test für Liquorfolat könnte ein wichtiges Hilfsmittel darstellen, um den zerebralen Folatmangel zu diagnostizieren. Die Quantifizierung der Folatformen in verschiedenen Probenmaterialien ist anspruchsvoll. Die meisten Methoden einschließlich der mikrobiologischen und Proteinbindungsteste bestimmen nur das Gesamtfolat und können nicht die verschiedenen Folatformen unterscheiden. Verschiedene analytische Probleme verzögerten die Entwicklung von Methoden für die wichtigsten Folatformen. Beispiele hierfür sind: die große Anzahl der Folate (hinsichtlich des Oxidationsstatus und der Anzahl der Glutamatreste), die komplexe Probenmatrix, die Instabilität und Interkonversion der Folate, die Anwesenheit von Folatbindeproteinen in den Proben. Folate sind einfacher im Serum zu bestimmen, wo sie als Monoglutamate vorkommen. Im Vollblut müssen Folylpolyglutamate, bevor sie gemessen werden können, zu den Monoglutamatformen dekonjugiert werden. Die Freisetzung der Folate im Vollblut muss unter genau festgelegter Temperatur, pH-Wert und Zeit erfolgen (1), weil andernfalls die Hämolyse unvollständig ist bzw. die Folate vom Hämoglobinmolekül abgefangen werden (2).

Stabilität der Folatformen in vitro (Präanalytik)

Reduzierte Folatformen sind empfindlich gegenüber Hitze, pH, Oxidation, Druck und UV-Licht. Daher müssen die Probenvorbereitung und die Messung unter kontrollierten Bedingungen erfolgen. Die Hauptabbauprodukte sind p-Aminobenzoyl-L-Glutaminsäure (pABG) und Pteridinfragmente, die keine Coenzymfunktion haben (3). THF, DHF und 10-Formyl-THF unterliegen in vitro einem raschen oxidativen Abbau. Außerdem werden diese reduzierten Folate pH-abhängig enzymatisch und nichtenzymatisch ineinander umgewandelt. De Brouwer et al. hat die pH- und Hitze-Stabilität individueller Folatformen in in vitro Experimenten zusammengefasst (4). FS und 5-Methyl-THF sind bei pH 2-10 stabil und 5-Formyl-THF ist bei 37°C und pH 3 – 10 relativ stabil. THF ist bei pH < 5 relativ stabil, wohingegen DHF bei pH > 8 relativ stabil ist. Im Gegensatz zur THF ist die DHF bei allen pH Bedingungen nach Erhitzen instabil. Bei niedrigen pH-Werten kann THF in vitro zu DHF und FS oxidiert werden. Um die reduzierten Folate während der Probenvorbereitung zu stabilisieren, ist es entscheidend, geeignete Antioxidantien wie Ascorbinsäure, β-Mercaptoethanol und Dithiothreitol zuzusetzen. Daneben kann artifizielle FS durch die Oxidation der THF während der Probenvorbereitung auch in der Anwesenheit von Antioxidantien gebildet werden (5). Dies kann zu fehlerhaften Interpretationen bei Studien führen, die in Proben unmetabolisierte FS untersuchen.

 

 

Referenzen

1.     Pfeiffer CM, Gregory JF, III. Enzymatic deconjugation of erythrocyte polyglutamyl folates during preparation for folate assay: investigation with reversed-phase liquid chromatography. Clin Chem 1996;42:1847-54.
2.     Wright AJ, Finglas PM, Southon S. Erythrocyte folate analysis: saponin added during lysis of whole blood can increase apparent folate concentrations, depending on hemolysate pH. Clin Chem 2000;46:1978-86.
3.     Eitenmiller RR, Lin Ye, Landen WO, Jr. Folate and Folic Acid. Vitamin Analysis for the Health and Food Sciences. CRC Press, 2007:443-506.
4.     De Brouwer V, Zhang GF, Storozhenko S, Straeten DV, Lambert WE. pH stability of individual folates during critical sample preparation steps in prevision of the analysis of plant folates. Phytochem Anal 2007;18:496-508.
5.     Kirsch SH, Herrmann W, Geisel J, Obeid R. Assay of whole blood (6S)-5-CH(3)-H (4)folate using ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Anal Bioanal Chem 2012;404:895-902.